麻痹性贝类毒素试验
中国科学院广州化学研究所分析测试中心
卿工----
中国科学院分析测试中心由国务院吸收国外先进技术于2005年组建。下设危险废物鉴定实验室、实验室，化学与药学分析室，材料与形貌分析室，环境与能源分析室，生物与药学分析室。
毒理学试验方法、急性经口毒性试验、急性经皮毒性试验、急性吸入毒性试验、急性皮肤刺激试验、眼刺激试验、皮肤变态反应（致敏）试验、亚急性经口毒性试验、亚急性经皮毒性试验、亚急性吸入毒性试验、亚慢性经口毒性试验、蓄积毒性试验、迟发性神经毒性试验、致突变试验
鞭甲藻属. alexandrium spp 、pyrodinium spp 、gymnodinium spp 。四种淡水蓝绿藻 : aphanizomenon flos-aquae 、anabaena circinalis 、lyngbya wollei 、cylindrospermopsis raciborskii.麻痹性贝毒是一类神经肌肉麻痹剂，对人体的作用机理主要是阻断细胞钠离子通道。造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。因毒素在贝类体内呈结合状态，贝类摄入此毒素本身无害，当人食入后，毒素会迅速释放并呈现毒性作用。类误食了含有麻痹性毒素的贝类后，中毒症状是从嘴唇周围发生轻微剌痛和麻木感，发展到全 身麻痹..并由于呼吸障碍而死亡。轻度嘴唇周围有剌痛感和麻木感逐步扩大到面部和颈部手指尖和脚趾的针剌感觉，可有头痛、眩晕和恶心。中度语无伦次，剌痛感发展至手臂和腿四肢强直和肢体失调，身衰弱和眩晕，轻度呼吸困难，脉搏加快。重度肌肉麻痹，明显地呼吸困难，窒息感，在没有呼吸机护理的条件下可能死亡。 1.2腹泻性贝类毒素 (dsp)
腹泻性贝类毒素是海洋中藻类产生的一类脂溶性次生代谢产物，因被人食用后产生以腹泻为特征的中毒效应而得名。贝类滤食后在其体内性质非常稳定，一般的烹调加热不能使其破坏。人类误食会产生以腹泻为主要特征的中毒症状，严重者可出现黄疸、急性萎缩性肝坏死，长期毒性效应可能导致癌症。目前尚无特效解毒剂。一般采取对症处理。尽管目前还没有因 dsp中毒致死的报道，但由于 dsp中毒症状与细菌性胃肠炎类似，极易混淆，使其流行比预想的要严重。dsp是由甲藻产生的，属于鳍藻属和原甲藻属。现已证明产生dsp的藻类主要有 7种鳍藻属fortii(日本)、acuminata(欧洲)acuta 、norvegica(斯堪的纳维亚)mitra 、rotundate、triposs .4种原甲藻属：小原甲藻 (p.minimum) 、dinoflagellates prorocentrum lima、prorocentrumconcavrm(或p.maculosum)、prorocentrum redfieldi. dsp的毒性机制主要在于其活性成分软海绵酸(okadaic acid oa)能够抑制细胞质中磷酸酶的活性，导致蛋白质过磷酸化，从而对生物的多种生理功能造成影响。对人类的毒性主要作用于人体的酶系统，对细胞蛋脂酶有强烈的抑制作用，可以使人肠道发炎引起腹泻。其主要症状是恶心、呕吐、腹痛、腹泻等胃肠道刺激症状。 1.3神经性贝类毒（nsp）
神经性贝类毒素主要是因贝类摄食短裸甲藻后在体内蓄积，人类一旦食用这些染毒贝类便会引起以麻痹为主要特征的食物中毒，或在赤潮区吸入含有有毒藻类的气雾，会引起气喘、 咳嗽、呼吸困难等中毒症状而得名。神经性贝类毒素是贝类毒素中唯一的可以通过吸入导致中毒的毒素。经性贝毒是到目前为止危害范围较小的一类毒素。主要表现为神经中毒的症状。 神经性贝类毒素主要来自于短裸甲藻 (ptychodisus brevis)、剧毒冈比甲藻 (gambierdiscums toxin-cus)等藻类。神经性贝类毒素属于高度脂溶性毒素，结构为多环聚醚化合物，主要为短裸。神经性贝类毒素的毒理与麻痹性毒素相似，作用于钠通道，作用位点与不同。引起钠通道维持开放状态，从而引起钠离子内流，造成神经细胞膜去极化。
1.4健忘性贝类毒素（asp）
健忘性贝类毒素是一种强烈的神经毒性物质，因可导致记忆功能的长久性损害而得名。中毒者表现出肠道症状和神经紊乱，严重的有短暂的记忆丧失现象。asp直到 1987年才被发现，其引起中毒的成份是软骨藻酸 (da)。它是一种强烈的神经毒性非蛋白氨基酸，能导致短期记忆功能长久损害，半数致死量（ld50）为 10g/kg. 这些藻类主要生长在美国、加拿大、新西兰等海域。在日本海域的微藻 chondria armata也可导致健忘性贝类毒素的发生。软骨藻酸是谷氨酸盐的拮抗物，可作用于中枢神经系统红藻酸受体，导致去极化、钙的内流以及最终导致细胞的死亡。软骨藻酸与其它兴奋性氨基酸如谷氨酸的协同作用可使提取物的毒性更强。
2 贝类毒素的检测方法
2.1小白鼠生物检实验法[2]
目前世界上81%的国家采用此种方法检测dsp和psd，对于nsp和asp的检测有的国家也用 该方法。
2.1.1麻痹性贝类毒素（psp）的检测——小白鼠生物实验法
1937年由 soer等人建立了 psp的小白鼠生物试验法，该方法是目前惟一得到国际公认的aoac标准生物检测 psp的方法。目前大约有 81%的国家采用该方法检测 psp。 取100~150g组织,匀浆。再取 100g样品加入 100ml的0.18mol/l的盐酸，搅拌并调 ph值至 3.0左右加热微沸 5min.冷却至室温再次调节ph在2.0~4.0。不得大于4.5。用酸水定容到 200ml。待上清液沉淀至呈半透明状态后或 3 000 r/min离心5 min取上清，小白鼠腹腔注射。根据死亡时间。判断毒性大小。结果以“鼠单位”(mu)来表示。 aoac鼠单位的定义：使一只20g重的小白鼠腹腔注射后15min内死亡的毒素最小剂量即为一个鼠单位.1mu的毒素含量相当于0.18g的stx。该方法在概括样品毒性方面相当有效..是目前最常用的分析、检测方法。易掌握，不需要使用专门仪器.但也有较多的限制。如该法不能确定样品中毒素结构，灵敏度低，其检出限约40μgstxeq/100g贝肉..该法在标准程序中不同小鼠的品系、批次、损伤程度和大小对毒素的灵敏度有很大的波动性，浪费较多的毒素和需使用活体动物，操作繁琐等。
2.12腹泻性贝类毒素(dsp)的检测——小白鼠生物实验法
小鼠生物测定法是检测贝类组织中dsp最普遍、常用的方法。该法是日本健康福利部提出的。是aoac(美国官方化学师协会)标准方法。其测量单位是鼠单位(mu)。该方法最低检出限量是0.05mu/g。换算为 dsp的毒力约为220μg/kg。一个鼠单位(mu)是指腹腔注射 0.5~10ml毒素溶液后，在 24h内致体重16~20g小鼠死亡的最小毒素量。在小鼠生物学检测中，所有的 dsp成分都可能被检测到，包括那些不引起腹泻以及对人类毒性未知的毒素。 操作过程为取200g样品，取其中肠腺或者全部组织，用丙酮匀浆，过滤，减压浓缩丙酮提取液再以溶解残渣。水洗醚层，浓缩存留的脂质提取物，用1%的吐温60生理盐水悬浮提取物按小白鼠体重计大约每只20g腹腔注射，24h观察存活情况，计算毒性。该方法的优点是技术容易掌握，不需要使用专门仪器。主要缺陷是操作繁琐。缺乏特异性(即不能鉴别 dsp毒素的各种成分)。动物死亡时间的判断受主观因素以及实验室动物喂养情况的影响。另外。其它脂类的干扰可能得到错误的结果(特别是游离脂肪酸对小鼠毒性影响很大..而且整体提取和肝提取得到的结果不同。我国的商检系统即使用的就是此方法。 2.13神经性贝类毒素（nsp）的检测——小白鼠生物实验法
取100g样品先后两次用300m l丙酮匀浆，过滤，丙酮提取液经56℃旋转蒸发近干，其剩余物用100ml二氯甲烷溶解开移人500ml的分液漏斗中，轻轻摇动，静置分层。二氯甲烷层经无水硫酸钠过滤后，洗脱液再经蒸发干燥后的存留部分即为样品脂质提取物。用 0.85%生理盐水〔含1%吐温60)将样品脂质提取物悬浮，制备成相当于含样品10g/ml浓度的悬浮液用于小白鼠腹腔注射，1ml/只。注射后观察、记录死亡时间。若小鼠中位数死亡时间小于8min稀释提取液，重新注射。死亡时间大于930min，结果为小于0.1mu/g，死亡时间 8~930min。结果按照死亡时间与小鼠单位换算表计。
2.14失忆性贝类毒素（asp）的检测——小白鼠生物实验法
asp的主要毒素成分是软骨酸藻(domoica cid ,da)。对da的小白鼠生物试验法类似于 psp的毒性分析。只是时间延长至4h以上。用30%的甲醇溶液提取贝类中的贝毒，水浴加热煮沸15min。自然冷却到室温..调整溶液ph6，3000 r/min离心 10min取上清，小白鼠腹腔注射，观察存活情况，计算其毒力。1987年该方法首次应用于加拿大贝毒事件中分离出的
微量da的测定。结果显示该方法对贝类组织中高浓度毒素成分的检测十分成功。但该方法不适用于作用水平在20ug/g以下的组织情况。 2.2 免疫化学法[3]
免疫分析技术分为酶联免疫吸附试验（elisa）。放射免疫分析（ria）和血球凝聚等。 最常用的是直接竞争性elisa（c-elisa）。原理是：游离的麻痹性贝类毒素与麻痹性贝类毒素酶标记物竞争麻痹性贝类毒素抗体。同时麻痹性贝类毒素抗体与捕捉抗体连接。没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后颜色由蓝色变为黄色..通过酶标仪测量吸光度值。样品中麻痹性贝类毒素含量与吸光度值成反比。检出限为0.03~100μg/孔 （0.3~1000μg/ml）。本法对样品处理要求较低干扰也少。而且快速、简便、灵敏、特异、经济。因此这种方法的推广应用有着广泛的前景。不足之处是对一些主要的衍生物有交叉反应或者反应不敏感。 2.3化学仪器分析
2.3.1高效液相色谱（hplc）检测法
hplc法是九十年代psp研究领域较成熟和普遍使用的理化检测技术。是一种非常快速的方法。是唯一能定性、定量检测出各种毒素组分的技术，被认为可以与小鼠生物测定法互 换。通过碱性氧化作用将毒素分子氧化成有色的或荧光衍生物，再通过荧光或紫外光检测系统进行分析，能对psp的成分及毒力进行准确的分析和测定分为过柱氧化法和柱前氧化法。目前一些发达国家如荷兰、加拿大等法定使用该法。hplc法灵敏度和回收率高。专一性强检出限低，检出限比小鼠生物检测法低，灵敏度是小白鼠分析法的 4～400倍。达到1μgstx eq./100g，最低检测值为0.5～25ng stx eq/100g。在酸性条件下不稳定的基团如氨甲酰基，n一磺基在分析的过程中不会解离，缩短了分析时间，通过自动注射技术，能处理更多的样品，便于进行毒素监控，能提供关于毒素的更多信息..能测出每 1个组分的具体含量及毒性的大小。但hplc法需要根据小鼠生物测定法进行广泛的标定，而且该方法存在 psp分析标准品全球缺乏的普遍问题，每种psp类似物的毒性种类都是唯一的，很多类似物很容易相互转化，对样品中的原始或潜在总毒性作出判断较困难的，需要昂贵的仪器。 2.3.2分光光度法
最早用于 psp分析，原理是将毒素分子吸附到阳离子交换树脂上，通过 jaffe反应将毒素分子中的胍基氧化成有色衍生物，洗脱后用分光光度仪检测。因该技术易被其它含胍基化合物干扰，测得结果往往比实际偏高。其检测范围为100~150μg/100g。 2.3.3电泳检测法
利用 psp中各种毒素分子所带电荷量不同，利用电泳技术初步分离，psp在醋酸纤维薄膜上涂氧化剂加热氧化。使毒素分子发生颜色反应，在紫外灯下检测。常用的是毛细管电泳，用于分离测定psp毒素中的非衍生毒素：stx，noestx等。 2.3.4色谱检测法 a、薄层色谱法
薄层色谱法和电泳技术在七、八十年代的使用频率较高。但均不够灵敏，且只能检测 7~9种psp。目前已很少人用。 b、气相色谱法
该技术已不再直接用于psp测定，仅在化学分类上做有机成分的粗略测定，将含psp的贝从无毒贝中鉴别出来。
3结束语
目前，海洋毒素已经成为世界上海洋环境工作者研究热点，我国的研究还远远不够，衡量贝类毒素也不完善。但随着科研进一步的深入，新的毒素不断被发现，因此，毒素标准的获取
成为一个难题。随着检测技术的提高，我们期待有更简便迅速的方法检测贝毒。海洋毒素是一种自然资源，人类在预防它毒性同时，也应该充分利用其生物活性作为生化和药物研究造福人类
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